常见误区与反面案例清单

面向大分子 CADD/AIDD 科学家与实验协作新人。每条按「典型说法 → 实际后果 → 替代做法」组织，多数条目在 24 周正文中有对应深入讨论（括号内标注周次）。先知道什么不能做，往往比知道怎么做更快避免损失。

使用方法

• 会议、报告评审、CRO 数据包审阅前，快速过一遍相关分类；
• 把本清单当作 review checklist，而不是批评工具——多数错误源于系统缺少防护，而非个人粗心；
• 数字示例均为教学合成数据，不对应任何真实项目。

一、Assay 设计与读数（7 条）

1. 「单点浓度筛选就代表 potency」

典型说法："10 nM 下 A 的信号是 B 的 2 倍，A 明显更强。"

后果：单点读数混淆亲和力、Emax、Hook 效应与线性范围，排序在完整曲线下经常翻转。

替代做法：完整剂量—反应曲线 + 4PL 拟合，报告 EC50 与 Emax 两个参数，并给出曲线顶部是否达到平台（W1、W10）。

2. 「同板三复孔 CV<5%，结果很可靠」

后果：技术复孔只反映加样与检测变异，不反映日间漂移、细胞状态与操作者差异；跨日独立实验可能相差数倍。

替代做法：区分技术重复与生物学重复；关键比较安排多个独立日期、独立传代，用 log EC50 的跨日 SD 判断区分窗口（W1、W12）。

3. 「曲线拟合 R²=0.99，拟合很好」

后果：R² 高不等于模型正确；权重方式、顶部/底部约束、异常点都会让 R² 虚高而 EC50 偏移。

替代做法：看残差分布而非只看 R²；报告拟合模型、权重、自由度与置信区间；关键样本用正交方法复核（W12）。

4. 「没有对照也没关系，样品趋势很清楚」

后果：无阴性/阳性对照的 assay 无法区分背景漂移、试剂失效与真实效应，跨批次数据不可比。

替代做法：每块板至少包含基质空白、阴性对照、阳性参考分子；跨批次用 reference molecule 建立 control chart（W12）。

5. 「Emax 80% 和 100% 只是平台差异」

后果：Emax 降低可能反映部分失活、表位遮蔽或机制性天花板，直接影响体内暴露覆盖的推算（EC90 变高）。

替代做法：Emax 差异必须追查样品质量（聚集、片段）与 assay 条件（密度、孵育时间），不能用"平台差异"一句话带过（W10、W22）。

6. 「读数越高越好，信号到顶了就稀释一下」

后果：盲目稀释掩盖 Hook 效应/前带效应——高浓度下信号反而下降，稀释后"看起来正常"，报告的 EC50 已系统性偏移（W13）。

替代做法：发现信号随浓度先升后降，立即检查 Hook 效应；对高浓度样本做稀释线性验证。

7. 「这个 assay 我们做了很多年，不需要验证」

后果：未按 intended use 验证的方法，其精密度、准确度与耐用性边界不明，"2 倍差异"的判定没有统计学基础。

替代做法：按 intended use 定义关键性能参数（精密度、准确度、线性范围、LLOQ/ULOQ、专属性），并设定三级接受标准（W12）。

二、结合与亲和力（5 条）

8. 「KD 0.1 nM 一定比 1 nM 好」

后果：KD 只反映平衡结合；kon/koff 的差别决定 residence time、内吞速率与重新结合机会，对 TCE/内吞类分子尤其关键。

替代做法：完整动力学（kon、koff、KD）+ 结合语境（可溶性抗原 vs 细胞表面、单体 vs 多价）；必要时用两种正交方法（W2）。

9. 「BLI 单浓度 ranking 足够筛序」

后果：单浓度响应混淆亲和力与活性蛋白比例；样品聚集或浓度偏差直接扭曲排序。

替代做法：ranking 只用于初筛；进入候选比较前做多浓度 kinetics，并报告参考分子同板结果（W2、W12）。

10. 「SPR 和 BLI 数字不一样，肯定是仪器问题」

后果：两平台方法学差异（固定方向、再生、质量传输效应）本就给出不同数值；盲目相信其一并否认另一，会漏掉真实的方法学伪差。

替代做法：先审方法（固定方向、再生条件、参考通道扣除），再判断差异来源；关键分子两平台结果都保留并注明条件（W12）。

11. 「抗原是我的同事表达的，肯定没问题」

后果：抗原折叠错误、聚集、标签遮挡表位，会使全部亲和力数值系统性偏移，而筛序看起来"一切正常"。

替代做法：抗原进入筛选前提交 QC（纯度、单体比例、活性/结合验证）；记录批次与储存历史（W2、W5）。

12. 「细胞结合和 SPR 结果应该一致」

后果：细胞表面抗原密度、糖基化、旁分泌干扰使细胞结合 EC50 与分子水平 KD 不存在简单换算；强求一致反而掩盖机制差异。

替代做法：把两者当作正交证据；不一致时优先检查抗原构型与密度，其次检查样品（W2、W3）。

三、细胞模型与功能实验（7 条）

13. 「只用 target-high 细胞做功能筛选」

后果：高表达细胞使弱分子"看起来有效"，选择性缺陷被完全掩盖；进入低表达模型后药效消失。

替代做法：Target-high / target-low / target-negative 三层细胞面板，功能结论必须同时报告选择窗口（W3、W10）。

14. 「E:T ratio 用的 10:1，EC50 很好」

后果：E:T 未报告或随意变化时，不同实验的 EC50 不可比；effector 过量会人为放大弱分子活性。

替代做法：明确固定 E:T 并在报告中说明；关键比较用同一 donor、同一 E:T，并做 E:T 梯度敏感性检查（W10）。

15. 「一个健康 donor 的 PBMC 结果就够了」

后果：donor 间 T 细胞组成与活化状态差异巨大，单 donor 结论在其他 donor 上可能不成立，临床人群外推完全无依据。

替代做法：至少 3 个独立 donor，报告个体数值而非只报均值；注明 HLA/供体筛选标准（W9、W10）。

16. 「ATP 下降了，说明靶细胞被杀伤」

后果：ATP 试剂盒测的是混合体系总活力——effector 细胞增殖、药物毒性、培养基消耗都会改变读数。

替代做法：区分靶细胞特异性读数（靶细胞标记 + 流式、靶细胞特异性报告系统），或至少设置 effector-only/靶细胞-only 对照（W10）。

17. 「24 小时杀伤排名就是最终排名」

后果：短时程实验偏向快 mechanism（直接细胞毒），低估依赖免疫突触形成与 serial killing 的分子。

替代做法：关键比较补 72–96 h 时程，观察 serial killing 与 cytokine 的动态关系（W10）。

18. 「细胞因子没测到升高，安全没问题」

后果：体外 CRA 的检测窗口、donor 选择与刺激条件都影响结果；"未检出"≠"无风险"。

替代做法：报告 assay 检测能力边界（细胞因子 panel、LLOQ、阳性对照响应），把结论限定在"该模型条件下未见信号"（W9）。

19. 「传代第 30 代的细胞和第 5 代一样」

后果：长期传代导致抗原表达漂移、生长速率改变与核型变化，历史数据与新数据不可比。

替代做法：记录并报告传代数；建立细胞库主代次；关键实验前用流式复核抗原表达（W3）。

四、样品与 CMC（5 条）

20. 「纯度 99%，直接进细胞实验」

后果：内毒素、宿主细胞蛋白、DNA 残留引起的细胞应答会被误读为分子活性或毒性；1 EU/mL 足以激活免疫细胞。

替代做法：进入细胞/动物实验前完成 endotoxin、单体比例与浓度复核；报告具体数值而非"合格"（W5、W6）。

21. 「样品冻融过几次没关系」

后果：冻融循环诱导聚集与片段化，Aggregation 会同时扭曲结合与功能读数，且影响 PK（快速清除）。

替代做法：分装冻存、记录冻融次数；实验前 SEC 复核单体比例；跨实验使用同一批次分装（W5、W6、W13）。

22. 「浓度用 A280 测过就行」

后果：聚集/片段使 A280 高估活性蛋白浓度；标称浓度与真实活性浓度偏差直接平移所有 EC50。

替代做法：A280 + 纯度校正；关键样品用氨基酸分析与活性校准互相印证（W6）。

23. 「两条分子同一个序列，历史批次数据可以混用」

后果：不同批次表达系统、纯化路线与储存历史不同，混用后数据"漂移"无法归因。

替代做法：建立样品台账（批次、表达日期、QC、冻融记录）；关键比较使用同一批次或证明批次间可比（W6、W12）。

24. 「上清直接拿来测功能」

后果：上清含培养基成分、宿主蛋白与无关抗体，功能读数不可归因；对 TCE 类分子甚至可能出现假阳性。

替代做法：上清只用于表达量初筛；功能比较使用纯化、QC 合格的样品（W5、W10）。

五、生物分析与 PK（5 条）

25. 「BLQ 数据按零处理就行」

后果：把低于定量下限的浓度记为 0 会人为拉低 AUC、扭曲终末相斜率与 t1/2。

替代做法：按方案预定义 BLQ 处理规则（缺失/0/LLOQ/2 或按统计分析计划），并报告各时间点 BLQ 比例（W13、W16）。

26. 「ADA 没测，不过应该没有」

后果：ADA 是抗体 PK 异常快速清除的最常见原因之一；不测 ADA 直接导致清除机制误判。

替代做法：PK 采血同步留样测 ADA（至少 screening + confirmatory）；异常个体先查 ADA 再讨论机制（W15）。

27. 「SC 给药算出来的 CL 就是清除率」

后果：SC 得到的是 CL/F，F 未知时"CL"混杂生物利用度；与 IV 数据直接比较会得出错误结论。

替代做法：报告 CL/F 并注明；需要真实 CL 时安排 IV 参照组（W8、W16）。

28. 「PK assay 测的是游离药」

后果：多数常规 LBA 测 total drug；靶点高表达时 total≠free，用 total 浓度推算靶点覆盖会系统性高估。

替代做法：明确 analyte 定义（total/free/活性）；关键覆盖推算用与机制匹配的 assay 构型（W13、W22）。

29. 「n=3 只小鼠的均值就能下结论」

后果：小鼠个体变异（ADA、TMDD、肿瘤吸收）下 n=3 的均值极不稳定；伪重复（同笼、同瘤块）进一步虚张自由度。

替代做法：预实验明确样本量依据；报告个体数据点；区分统计检验单位与测量单位（W16、W18）。

六、动物药效与转化（6 条）

30. 「TGI 90%，药效非常好」

后果：TGI 只反映组均值在单时间点的相对变化；基线不平衡、个体回缩不持续、退出动物被剔除都会让 TGI 虚高。

替代做法：TGI 必须与个体曲线、基线平衡、退出/删失原因、体重曲线联读；报告公式与时间点定义（W19）。

31. 「组均值±SEM，误差棒很小，差异稳定」

后果：SEM 只反映均值的精密度而非个体变异；n 小时 SEM 系统性小于 SD，视觉上夸大显著性。

替代做法：药效个体数据优先用 SD 或直接展示个体点；小样本非正态数据考虑中位数与范围（W19，另见统计学基础参考）。

32. 「体重下降 15%，但 TGI 100%，值得」

后果：体重下降是耐受性红旗；毒性导致的"药效"（动物进食下降、肿瘤生长同步抑制）在临床不可转化。

替代做法：体重下降超方案阈值即触发暂停/安乐死规则；药效结论必须与耐受性联合报告（W18、W19）。

33. 「CDX 模型有效，临床应该也有效」

后果：CDX 细胞系经长期培养已失去患者异质性；免疫重建模型与人类免疫系统的差距更大。

替代做法：明确模型能回答什么问题（相对比较 vs 绝对预测）；转化结论限定边界，优先看暴露—效应关系而非单一 TGI（W17、W20）。

34. 「先看药效，采样计划以后再说」

后果：无 PK 配套的药效实验无法区分"分子无效"与"暴露不足"——这是最昂贵的不可逆错误之一。

替代做法：药效研究同步设计卫星组或稀疏采样，至少获得 Ctrough 覆盖证据（W18、W22）。

35. 「一个模型做出来就行，重复实验太贵」

后果：单次单模型药效受接种批次、随机化与个体变异影响大；不可重复的结果进入决策链代价更高。

替代做法：关键 go/no-go 决策至少两个独立研究或两个模型（含 target-low），并预定义成功标准（W17、W23）。

七、统计与决策（4 条）

36. 「p<0.05，A 显著优于 B」

后果：小样本下 p 值对效应量与设计极其敏感；"显著"不代表差异大到值得决策，更不代表可重复。

替代做法：报告效应量、置信区间与独立重复次数；决策基于方向一致性 + 效应量 + 生物学合理性（见统计学基础参考）。

37. 「做了 10 个终点，其中 3 个 p<0.05」

后果：多重比较不校正，假阳性按终点数累积；"挑显著的讲"让数据包看起来漂亮但不可信。

替代做法：方案预定义主要终点；探索性终点明确标注并降权处理（W18，统计学参考）。

38. 「投票打分加总，分高者胜」

后果：加权评分的权重与量纲未经审视时，结果由任意假设主导；敏感分子一票否决的维度（安全、可开发性）可能被均分稀释。

替代做法：权重预先透明化 + 敏感性分析；veto 维度独立于加权分（W23）。

39. 「口头报价说没问题，预算就按这个做」

后果：无验收标准与失败条款的报价在返工时变成无限追加；数据格式与原始数据交付不明确导致后期无法审计。

替代做法：任何外委实验用 RFQ 固定规格、验收标准、失败处理与原始数据交付（见 RFQ 模板）。

与正文的联动

本清单为教学用途编写的合成示例，不指向任何真实项目或个人；实际研究以机构 SOP、获批方案与质量体系为准。