候选	kon (M⁻¹s⁻¹)	koff (s⁻¹)	KD
A	1×10⁶	1×10⁻³	1 nM
B	1×10⁵	1×10⁻⁴	1 nM

第 2 周学习包：结合、亲和力与细胞结合

本周核心问题

纯化抗原结合很好，为什么细胞结合或功能不一定好？

本周建立从纯化抗原到细胞表面靶点的证据链：

样品质量
→ ELISA 初筛
→ SPR/BLI 动力学
→ 细胞表面结合
→ competition/blocking
→ 细胞功能

这条链不是“逐级盖章”。每种 assay 都改变了抗原呈现方式、空间几何和读数机制，因此跨 assay 不一致往往比一致更有信息量。

一、学习目标

完成本周后，应能够：

解释 ELISA 信号、ELISA EC50 和 affinity 的区别；
阅读 SPR/BLI sensorgram，理解 association、dissociation、kon、koff、KD 和 Rmax；
识别固定化方向、mass transport、rebinding、avidity 和 regeneration 等伪差；
解释为什么简单 1:1 模型并不总适合抗体数据；
阅读 flow cytometry cell-binding 曲线与基本 gating；
区分 cell-binding EC50、阳性率和 MFI；
区分 competition、blocking 和 epitope binning；
用正交证据判断 affinity—cell binding—function 是否一致；
写出一份结合实验报告必须包含的字段。

二、学习时间安排

标准版：4 小时

学习块	时间	任务	产出
课前诊断	20 min	完成 10 道诊断题	盲点清单
ELISA 与结合筛选	40 min	学习第 4 节	ELISA 解释边界表
SPR/BLI	80 min	学习第 5 节	sensorgram 审查表
细胞结合与竞争	60 min	学习第 6–7 节	cell-binding 审查表
综合案例	40 min	完成候选排序	决策与补实验
闭卷验收	20 min	完成十题测验	得分与错题

深入版：6 小时

额外增加：

45 分钟：阅读 NIH kinetic binding 指南；
45 分钟：找一份真实 SPR/BLI 报告，逐条检查拟合与 residual；
30 分钟：找一份 flow cell-binding 报告，重画 gating tree；
30 分钟：向实验同事讲解“为什么 ELISA EC50 不是 KD”。

三、课前诊断

ELISA OD450 越高，是否代表 affinity 越高？
ELISA EC50 能否直接与 SPR KD 比较？
为什么全长双价 IgG 测固定化抗原时容易出现 avidity？
同一个 KD 能否由不同的 kon 与 koff 组合产生？
什么是 mass-transport limitation？
sensorgram 拟合线很好，是否足以证明模型正确？
cell-binding EC50 是否是平衡解离常数？
isotype control 能否代替 target-negative cell？
两个抗体互相竞争，是否必然识别同一个氨基酸表位？
纯化抗原 affinity 好而细胞功能差，至少列出五个原因。

四、ELISA：适合回答什么，不适合回答什么

酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）常见格式如下。

4.1 常见格式

格式	固相上是什么	主要用途	常见风险
Antigen-down/direct binding	抗原	抗体结合初筛、滴度比较	包被变性、取向随机、表面高密度
Capture ELISA	捕获试剂，再捕获抗原/抗体	尽量保留构象、定量分析物	capture/detection 位点干扰
Sandwich ELISA	两个识别不同位点的抗体	抗原定量	hook effect、基质效应
Competitive ELISA	待测物与标记物竞争	阻断或相对结合能力	IC50 强依赖各组分浓度

4.2 ELISA 信号由什么共同决定

ELISA 的终点信号并不只由 affinity 决定，还受到：

固相抗原密度与取向；
抗原在塑料表面的构象完整性；
抗体价态和 avidity；
孵育是否达到近似平衡；
洗涤强度与次数；
二抗、酶和显色底物；
读板时间、背景扣除与信号饱和；
样品聚集和非特异吸附。

因此，ELISA EC50 更准确的表达是：

在该包被、孵育、洗涤和检测条件下达到拟合信号中点的抗体浓度。

它可以用于同一实验内的相对筛选，但通常不是热力学 KD。

4.3 读 ELISA 曲线时看什么

是否有完整 Top 和 Bottom；
blank、secondary-only、irrelevant antigen 和 reference antibody 是否正常；
原始 OD 是否进入检测饱和区；
候选曲线差异来自 EC50、Top，还是两者都有；
技术复孔是否只是同一块板；
抗原构建、包被量和批次是否一致；
高浓度端是否出现非特异信号或 hook/prozone-like 现象；
排名是否被正交方法复现。

4.4 ELISA 的合理项目用途

大量候选的快速 bind/no-bind 筛选；
相同条件下的相对滴度或阻断排序；
判断某些抗原构建或标签是否影响结合；
为后续动力学实验缩小候选范围。

不建议仅凭 ELISA 排名声称 affinity maturation 成功。

五、SPR/BLI：从 sensorgram 到可信动力学

表面等离子共振（surface plasmon resonance，SPR）和生物层干涉（bio-layer interferometry，BLI）是常用的实时无标记结合平台。

5.1 两种平台的共同逻辑

SPR 和 BLI 都可实时观察结合过程。典型 sensorgram 包含：

baseline
→ association：分析物进入并结合
→ dissociation：停止供给分析物后复合物解离
→ regeneration 或下一循环

在简单 1:1 可逆模型下：

KD = koff / kon
t1/2,dissociation = ln(2) / koff

其中半衰期关系只适用于相应模型和近似一阶解离条件，不能直接外推到细胞或体内驻留时间。

5.2 SPR 与 BLI 的差异要点

维度	SPR	BLI
读数原理	表面等离子共振折射率变化	生物层干涉光学厚度变化
流体方式	常见连续流路	常见探针浸入微孔板
主要优势	灵敏、成熟的动力学与表面化学体系	并行度高、样品操作灵活
典型风险	流路、bulk shift、mass transport、再生	蒸发、摇速/混合、孔间差异、非特异吸附

平台名称不决定数据质量。实验构型、样品质量和模型适配更重要。

5.3 谁固定、谁在溶液中

固定化策略会改变：

分子取向和表位可及性；
表面密度；
双价抗体能否同时抓住两个抗原；
rebinding 概率；
活性分子比例；
是否需要 regeneration。

常见选择：

直接偶联：稳定但取向可能随机；
capture：例如 Protein A/G、anti-Fc、标签捕获，方向更可控且易更换 ligand；
biotin–streptavidin：常较稳定，但生物素化位置与程度仍需确认。

若目标是测单价 affinity，常见策略是降低表面密度，并考虑使用 Fab/scFv 或让抗体作为 ligand、单体抗原作为 analyte。具体构型取决于分子状态与问题，不存在一套永远正确的方向。

5.4 可信 sensorgram 的基本特征

浓度依赖清楚；
reference surface 与 blank injection 已正确扣除；
association 和 dissociation 段覆盖足够时间；
signal 未明显超出合理 Rmax；
重复浓度或重复循环表现一致；
residual 随机分布，而非系统性弯曲；
参数在不同浓度子集或独立实验中相对稳定；
样品单体状态、浓度和活性明确。

5.5 六类常见伪差

1. Mass-transport limitation

分析物从体相输送到传感器表面的速度成为限制步骤，观察到的 association 不再主要反映真实 kon。

提示信号：提高流速、降低表面密度后拟合参数改变；不同浓度曲线形态异常相似。

2. Rebinding

刚解离的分析物在离开表面前再次结合邻近 ligand，使表观 koff 变慢、KD 看起来更好。高表面密度和多价体系尤其容易发生。

3. Avidity

双价 IgG 同时或先后抓住多个固定抗原，得到的是多价表观结合，而非单个 paratope—epitope 的内在 affinity。

4. Ligand heterogeneity

固定化分子存在不同取向、不同活性状态或多个结合状态，1:1 模型可能用一个“平均参数”掩盖异质性。

5. Bulk/refractive-index effect

样品缓冲液与运行缓冲液不匹配会产生与真实结合无关的响应偏移。高盐、甘油、DMSO 或不同蛋白基质均可能影响。

6. Regeneration damage

再生条件逐渐破坏 ligand 或改变表面活性，导致后续循环响应下降。应检查 cycle order、重复 control 和 surface capacity。

5.6 模型不是自动真相

1:1 Langmuir 拟合适合“一个活性 analyte 与一个均一 ligand 位点发生单步可逆结合”的近似情形。

以下情况需谨慎：

analyte 或 ligand 多价；
抗原寡聚；
构象变化或两步结合；
非特异结合；
表面异质；
mass transport 显著；
浓度或活性分数不准确。

不要只看软件给出的 χ² 或彩色拟合线。模型合理性、参数稳定性和 residual 同等重要。

5.7 SPR/BLI 报告最少字段

类别	必须记录
分子	ligand/analyte 构建、价态、标签、批次、纯度/单体比例
构型	谁固定、捕获方式、表面密度或响应水平
条件	温度、缓冲液、流速/摇速、板型或芯片类型
设计	analyte 浓度系列、association/dissociation 时间、重复
对照	reference surface、blank、非相关分子、reference antibody
处理	reference subtraction、double referencing、排除规则
拟合	模型、全局/局部拟合、kon、koff、KD、Rmax、residual
质量	regeneration 稳定性、重复性、异常曲线及说明

六、Flow cytometry cell binding

6.1 它回答的不是同一个问题

Cell binding 将靶点放回膜、糖基化、聚集状态与细胞微环境中，回答：

候选能否在指定细胞、指定靶密度和指定染色条件下结合可及的细胞表面靶点？

它不直接给出严格的单价 KD。

6.2 基本 gating 路径

all events
→ FSC/SSC 去除明显碎片
→ singlets 去除 doublets/聚团
→ live cells
→ 目标细胞群
→ 抗体结合信号

应保存完整 gating tree、代表性散点图/直方图和每一步 event count。只提供最终 MFI 表格不足以判断数据质量。

6.3 常见读数

MFI/median fluorescence：群体荧光中心位置；需说明 mean 还是 median；
ΔMFI 或 fold over background：相对背景变化；高度依赖背景定义；
% positive：超过预设 gate 的细胞比例；阈值和对照决定结果；
cell-binding EC50：达到拟合细胞信号中点的抗体浓度；
Bmax-like plateau：在该检测体系中的最大细胞信号，不等同于绝对 receptor number。

6.4 必要对照

unstained；
secondary-only（使用二抗检测时）；
target-negative 或 knockout cell；
parental/mock-transfected cell；
isotype/non-binding antibody；
reference antibody；
viability dye；
多色实验中的 single-color compensation controls 和必要的 FMO controls；
若怀疑 Fc receptor 介导背景，加入 Fc block 或 Fc-silent comparator。

isotype control 与 target-negative cell 不可互相替代：前者主要帮助评估非特异抗体背景，后者直接测试靶点依赖性。

6.5 常见失败模式

抗体浓度未滴定，所有候选都在饱和区；
细胞活率低，死细胞产生高背景；
未排除 doublets；
只测工程 target-high 细胞；
检测二抗与细胞 Fc receptor 结合；
候选标记程度不同导致 MFI 不可比；
细胞 passage、培养密度或诱导条件改变靶表达；
靶点内吞使孵育温度和时间改变结果；
抗体聚集造成非特异细胞表面结合。

七、Competition、blocking 与 epitope binning

7.1 三个概念

Competition：一个分子的存在降低另一个分子的结合；
Blocking：候选降低配体—受体相互作用或下游功能；
Epitope binning：按抗体能否同时结合目标，将候选分入相对表位组。

7.2 “竞争”不必然等于“同一表位”

两个抗体不能同时结合可能因为：

直接共享关键表位；
表位空间相邻，发生 steric hindrance；
第一个抗体诱导构象变化；
固定化方向或表面密度限制；
抗原寡聚状态改变；
assay 未达到适当占有或平衡。

相反，两个抗体在一种 assay 中不竞争，也不保证在细胞膜环境中能同时结合。

7.3 Blocking IC50 依赖实验条件

IC50 会受到候选、配体、受体浓度，孵育顺序、时间和底物消耗影响。跨实验比较 blocking IC50 前，必须确认条件一致。

八、为什么纯化抗原 affinity 好，细胞结合/功能可能差

层面	可能原因	建议证据
抗原构建	可溶 ectodomain 与膜上全长构象不同	不同构建、cell binding
抗原状态	标签、寡聚、糖基化或折叠不同	正交构建、质量分析
表位可及性	膜距离、邻近蛋白或 glycocalyx 遮挡	细胞系面板、结构/突变分析
靶密度	低密度不足以产生 avidity 或功能阈值	定量流式、high/low panel
动力学	koff、kon 与 assay 时间尺度不匹配	完整 kinetics、不同孵育时间
价态/几何	结合存在但不能形成有效交联/突触	Fab/IgG 比较、功能 assay
内吞/周转	靶点快速内吞或 shedding	internalization、soluble target
样品问题	聚集、活性分数或浓度标定错误	SEC、浓度复核、重制样品
细胞背景	Fc receptor、死细胞或非特异吸附	Fc block、活率、KO cell
功能链路	结合位点不影响机制或下游通路缺失	blocking、signaling、orthogonal function

九、《结合证据审查十二问》

样品单体比例、浓度、批次和活性是否合格？
assay 中使用的抗原构建、标签、寡聚和糖基化状态是什么？
分子的价态是什么，结果是 affinity 还是 apparent avidity？
ELISA 是否处于动态范围，有无包被和二抗伪差？
SPR/BLI 中谁固定、密度多高、为什么这样设计？
是否有 reference surface、blank cycle 和 reference antibody？
sensorgram 是否覆盖完整 association/dissociation，residual 是否随机？
1:1 模型是否与体系相符，参数在重复或不同设计中是否稳定？
cell binding 是否使用活细胞、singlet gating 和 target-negative/KO 对照？
cell-binding 浓度是否覆盖上下平台，细胞靶密度是否已知？
competition/blocking 结果排除了哪些解释，仍可能有哪些替代解释？
结合结果如何与功能结果相互支持或冲突，下一项判别实验是什么？

十、综合案例：五个抗体的结合证据

以下为教学数据。

候选	ELISA EC50	BLI KD	BLI 特征	target-high cell EC50	target-low cell EC50	ligand blocking	SEC 单体%
A	0.08 nM	0.7 nM	1:1 拟合稳定	1.1 nM	12 nM	88%	99.1
B	0.03 nM	0.2 nM	极慢 koff，高表面密度	9 nM	>100 nM	20%	98.8
C	0.6 nM	1.5 nM	kinetics 清晰	0.8 nM	4 nM	92%	99.4
D	0.05 nM	0.4 nM	residual 系统弯曲	0.5 nM	2 nM	90%	90.2
E	1.2 nM	3.0 nM	kinetics 清晰	1.4 nM	8 nM	12%	99.0

补充信息：

BLI 使用高密度固定化抗原和全长 IgG analyte；
D 样品存在可见肩峰；
细胞 assay 只有一次实验的技术复孔；
C 与 A 竞争，但两者尚未做结构表位验证。

问题

哪两个候选最值得优先进入独立细胞功能验证？
B 的 BLI KD 最好，为什么不能直接排第一？
D 的细胞数据最好，为什么仍应暂停推进？
C 与 A 竞争，可以得出什么、不能得出什么？
为 B 设计一个最小的动力学复核方案。
如果项目机制要求 ligand blocking，E 是否应保留？

十一、核心术语

术语	一句话定义
Sensorgram	实时结合响应随时间变化的曲线
Association	analyte 与 ligand 结合、复合物累积的阶段
Dissociation	停止供给 analyte 后复合物解离的阶段
Rmax	给定表面与模型下可达到的理论/拟合最大响应
Reference surface	不含目标 ligand 或含对照 ligand 的扣背景表面
Double referencing	同时扣除 reference surface 与 blank injection
Immobilization	将一个结合伙伴固定到传感器表面的过程
Capture	通过 Fc、标签或其他配对试剂可逆/定向捕获 ligand
Mass transport	analyte 从体相输送到表面的过程
Rebinding	analyte 解离后在离开表面前再次结合
Regeneration	去除已结合 analyte、恢复表面用于下一循环
Residual	实测响应与模型拟合响应之间的差值
Apparent KD	在复杂构型/多价效应下得到的表观解离常数
Cell-binding EC50	在指定细胞染色条件下达到信号中点的浓度
MFI	细胞群体荧光强度的均值或中位数，必须注明定义
FMO	fluorescence minus one，多色流式中缺少一个标记的控制
Fc block	降低检测抗体与细胞 Fc receptor 非特异结合的处理
Competition	一个分子降低另一个分子结合的实验现象
Blocking	候选阻止配体—受体结合或相应功能的能力
Epitope binning	按候选能否同时结合目标划分相对表位组

十二、闭卷验收

每题 2 分，共 20 分。

为什么 ELISA EC50 通常不是 KD？
写出 KD、kon、koff 的关系。
解释 mass transport 与 rebinding 的差别。
为什么高密度固定抗原加全长 IgG 容易高估 affinity？
sensorgram 拟合报告至少要看哪五项？
cell-binding EC50 与 KD 有什么不同？
isotype control 与 target-negative cell 各回答什么？
两个抗体竞争为什么不必然表示同一精确表位？
列出纯化抗原结合好而细胞结合差的五个原因。
为一个 affinity maturation 项目写出最小正交验证链。

评分：17–20 通过；13–16 订正后 teach-back；12 分及以下重做综合案例。

参考要点

ELISA EC50 同时受包被密度、抗原取向、avidity、孵育/洗涤和检测系统影响，是条件性信号中点而非热力学常数。
KD = koff / kon。
Mass transport 是 analyte 到达表面的输送成为限速；rebinding 是已解离 analyte 离开表面前再次结合。
高密度固定抗原允许双价 IgG 发生 avidity 与 rebinding，使表观 koff 变慢、KD 偏低。
至少检查原始曲线、reference/blank、浓度依赖、association/dissociation 覆盖、模型、参数稳定性、Rmax 与 residual。
Cell-binding EC50 是指定细胞、靶密度、价态、时间和检测条件下的信号中点，不是严格单价 KD。
Isotype 辅助评估非特异抗体背景；target-negative/KO 直接检验靶点依赖性。
竞争还可由邻近表位空间位阻、构象变化和 assay 几何造成。
可包括抗原构建/糖基化差异、表位遮挡、靶密度、内吞、动力学、价态几何、样品质量和细胞背景。
一个合理链条是样品 QC → 初筛 → 低伪差的 SPR/BLI kinetics → high/low/negative cell binding → 机制相关 blocking/function → 独立重复。

十三、本周最终产出

一页《结合证据审查十二问》；
一份真实 SPR/BLI 报告的 sensorgram 审阅记录；
一张 flow cell-binding gating tree；
五候选案例的排序与补实验；
5 分钟讲稿：“为什么纯化抗原 affinity 好不等于细胞功能好”。

十四、精选资料

NIH/NLM Analyzing Kinetic Binding Data；
NIH/NLM Immunoassay Methods；
Cossarizza 等：Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies, third edition；
NIH/NLM Basic Guidelines for Reporting Non-Clinical Data。

十五、学习记录模板

日期：
实际学习时长：

读过的结合报告：
最可信的一条证据：
最可疑的一条证据：
可能的 assay artifact：
建议的判别实验：

本周测验得分：__/20
需要向实验同事确认：