第 11 周学习包：ADCC、CDC、Reporter、内吞与 ADC 功能链
本周核心问题
当项目说“这个抗体有功能”时，功能究竟发生在受体信号、Fc 效应、内吞、payload 释放还是最终细胞死亡的哪一层？
一、学习目标
完成本周后，应能够：
- 区分 ADCC、CDC、ADCP 和直接受体功能；
- 比较 primary effector-cell assay 与 FcγR reporter assay；
- 解释 complement source、靶密度和调节蛋白对 CDC 的影响；
- 设计阻断、激动、增殖和凋亡 assay 的对照；
- 区分 receptor occupancy、surface loss、internalization 和 lysosomal delivery；
- 拆解 ADC 的 binding→internalization→trafficking→catabolism→payload→death 链；
- 识别一个末端 viability 读数无法定位失败步骤；
- 根据分子机制选择最小正交 assay panel。
二、学习时间安排
标准版：4 小时
| 学习块 | 时间 | 任务 | 产出 |
|---|---|---|---|
| 诊断 | 15 min | 10 题 | 盲点清单 |
| Fc effector | 70 min | ADCC/CDC/ADCP/reporter | 方法矩阵 |
| 直接功能 | 40 min | blocking/agonism/proliferation/apoptosis | 机制图 |
| 内吞与 ADC | 70 min | 拆解多步链 | failure map |
| 案例与验收 | 45 min | 定位失败步骤 | 决策 note |
深入版：6 小时
- 阅读 ADCC reporter validation 和 ADC trafficking 综述各 45 分钟；
- 找一套 flow internalization 图，重建 gating 与归一化 30 分钟；
- 比较 naked antibody、ADC、free payload 和 non-binding ADC 60 分钟；
- 与实验同事复盘一次 mechanism-of-action assay tree 30 分钟。
三、课前诊断
- FcγRIIIa reporter signal 是否等于真实靶细胞杀伤？
- NK-cell ADCC 与 PBMC ADCC 能直接比较吗？
- CDC assay 中 complement 批次为何关键？
- target binding 相同是否保证 ADCC 相同？
- surface signal 下降是否一定表示内吞？
- 酸洗能帮助区分什么？
- ADC 内吞快是否一定杀伤强？
- free payload 杀伤而 ADC 不杀伤，失败可能在哪些层？
- reporter assay 的优势是什么、代价是什么？
- 为什么不能只用一个 72 h viability assay 证明 ADC 机制？
四、Fc 介导效应
4.1 ADCC
Antibody-dependent cellular cytotoxicity 通常包含：
抗体结合 target cell
→ Fc 与 effector-cell FcγR 结合
→ effector activation/degranulation
→ target-cell death关键变量：
- 抗原密度和表位几何；
- IgG 亚型与 Fc 工程；
- Fc 糖基化，尤其 afucosylation；
- FcγRIIIa 等受体表达/多态性；
- NK、PBMC 或 engineered effector；
- E:T、时间与 target-cell sensitivity；
- 抗体聚集和样品质量。
4.2 Primary-cell ADCC 与 reporter assay
| 维度 | Primary effector ADCC | FcγR reporter |
|---|---|---|
| 读数 | target death、degranulation、cytokine | 受体通路驱动的发光等 |
| 生物相关性 | 更接近真实细胞网络 | 代表定义明确的 proximal signal |
| 变异 | donor 和亚群差异大 | 通常更稳定、易转移 |
| 通量 | 较低 | 较高 |
| 局限 | 复杂、机制归因困难 | 不直接测真实杀伤 |
Reporter assay 适合批次比较、potency 和机制桥接，但其 EC50/Emax 不应被称为真实 ADCC killing，除非明确读数定义。
4.3 CDC
Complement-dependent cytotoxicity：抗体在细胞表面形成适合 C1q/补体激活的排列，最终形成膜攻击复合物或其他补体效应。
关键变量：
- complement 来源、批号、活性和物种；
- target density、表位高度和抗体聚簇；
- IgG 亚型与 Fc 构型；
- CD46、CD55、CD59 等补体调节蛋白；
- 血清比例、孵育时间、细胞状态；
- heat-inactivated complement 和无抗体对照。
4.4 ADCP
Antibody-dependent cellular phagocytosis 常由 macrophage/monocyte 等吞噬细胞介导。必须区分：
- effector 吞入完整 target；
- 仅发生 trogocytosis 或膜转移；
- target 自然死亡后被清除；
- 染料转移造成假阳性。
需要成像、双细胞标记或其他正交方法确认“真正吞噬”。
五、直接受体功能 assay
5.1 Blocking/neutralization
链条为：
ligand–receptor interaction
→ proximal signaling
→ downstream transcription/phenotype常见读数：配体竞争、磷酸化、second messenger、reporter gene、细胞增殖/分化或 cytokine。
阻断率受 ligand 浓度、受体密度和孵育顺序影响，IC50 不是分子固定常数。
5.2 Agonism
激动可能要求受体二聚、特定构象或 FcγR-mediated crosslinking。至少比较：
- soluble antibody；
- plate-bound/secondary crosslinked；
- Fc-active 与 Fc-silent variants；
- receptor-negative/KO；
- pathway-specific inhibitor。
5.3 Proliferation 与 apoptosis
常见 readout：
- 细胞计数/染料稀释/核苷类似物掺入；
- ATP/代谢活性；
- Annexin V、caspase、膜完整性；
- 细胞周期和长期 colony formation。
单一 ATP 读数不能区分增殖变慢、代谢抑制和死亡。若项目结论是 apoptosis，至少应有机制更直接的正交指标。
六、受体占有与内吞
6.1 四个容易混淆的概念
- Receptor occupancy（RO）：靶点中被药物占据的比例；
- Surface binding：当前细胞表面可检测的抗体/靶点；
- Internalization：表面复合物进入细胞；
- Downregulation：总或表面受体减少，可由内吞、降解、剪切或表达变化造成。
6.2 常见内吞策略
| 方法 | 核心读数 | 主要风险 |
|---|---|---|
| Flow surface-loss | 随时间表面信号下降 | 抗体解离、epitope masking、受体 shedding |
| Acid wash/stripping | 去除表面结合后看胞内信号 | stripping 不完全或损伤细胞 |
| pH-sensitive dye | 酸性胞器中荧光增强 | 染料偶联改变结合，酸化不等于 lysosome |
| Confocal colocalization | 与 endosome/lysosome marker 共定位 | 定量、视野选择和分辨率限制 |
| Labeled cargo quantitation | 胞内累积/降解 | 标签残留可能与完整药物不同步 |
报告内吞率前需定义分母：初始表面结合、总结合、细胞数还是最大可内吞信号。
七、ADC 的多步功能链
7.1 每一步的问题与 assay
| 步骤 | 问题 | 典型 assay |
|---|---|---|
| Binding | ADC 是否保持抗原结合？ | SPR/BLI、cell binding |
| Internalization | 复合物是否进入细胞？ | flow、pH dye、imaging |
| Trafficking | 是否到达合适 endosome/lysosome？ | colocalization、live imaging |
| Catabolism/linker cleavage | payload 是否释放为活性形式？ | LC-MS/catabolite analysis |
| Payload mechanism | payload 是否命中 tubulin/DNA/TOP1 等？ | pathway biomarker、cell cycle/DNA damage |
| Cytotoxicity | 靶细胞是否死亡？ | viability、apoptosis、clonogenic |
| Bystander effect | 邻近 target-negative 是否受影响？ | mixed-cell/3D coculture |
7.2 必要对照
- naked antibody；
- free payload；
- non-binding isotype ADC（匹配 linker/payload/DAR）；
- target-negative/KO cells；
- reference ADC；
- 必要时 non-cleavable vs cleavable linker；
- DAR/聚集/游离 payload QC。
7.3 常见失败定位
结合差 → 抗体/偶联损伤或表位问题
结合好、内吞差 → 靶点/表位/受体 trafficking 问题
内吞好、lysosome delivery 差 → routing 问题
delivery 好、payload marker 无 → cleavage/catabolism 问题
payload marker 有、死亡弱 → 细胞耐药/阈值/外排问题
target-negative 也强杀 → free payload、bystander 或非特异摄取八、最小 assay panel 选择
| 分子机制 | 必要一线 | 关键正交 |
|---|---|---|
| Fc-enhanced mAb | cell binding + reporter/primary ADCC | target-specific killing、FcγR binding |
| CDC mAb | cell binding + active complement killing | C1q/complement deposition、regulator profile |
| Blocking mAb | ligand competition + proximal signal | downstream phenotype |
| Agonist mAb | receptor-specific signaling | Fc/crosslink dependence、functional phenotype |
| ADC | cell binding + target-specific cytotoxicity | internalization/trafficking、catabolite/MoA marker |
九、报告审查清单
十、综合案例
ADC-Q 的数据：
- cell binding 与 naked mAb 相同；
- pH-sensitive dye 信号强；
- 72 h target-positive viability 仅下降 20%；
- free payload 强效；
- non-binding ADC 无杀伤；
- lysosome marker 共定位低；
- DAR 和 monomer 合格。
参考分析
证据支持 ADC 结合并进入酸性 compartment，但未充分到达 lysosome 或后续 trafficking/catabolism 受限。下一步优先做更直接的 endosome/lysosome routing、细胞内 catabolite 和 payload MoA biomarker，而不是只提高 ADC 浓度。pH dye 强不等于已完成有效 payload release。
十一、闭卷验收与答案
- ADCC 的 proximal 与 distal readout？——FcγR signal/degranulation vs target death。
- Reporter assay 等于真实杀伤吗？——不等于。
- CDC 三个关键变量？——补体、靶密度/表位、调节蛋白等。
- surface loss 等于内吞吗？——不一定，还有解离、masking、shedding。
- RO 与内吞的区别？——占有比例 vs 复合物进入细胞。
- ADC 内吞快为何仍可无杀伤？——routing、cleavage、payload resistance 等。
- free payload 对照回答什么？——细胞对 payload 机制是否敏感。
- non-binding ADC 回答什么？——target-independent uptake/free payload/bystander。
- apoptosis 结论需要什么？——caspase/Annexin 等机制正交证据。
- assay tree 原则？——每个机制节点至少有合适读数和关键对照。
十二、本周最终交付物
选 ADCC、CDC、agonist 或 ADC 中一个机制，提交两页 assay tree：每一步的生物学问题、readout、对照、接受标准、失败解释和下一步决策。