大分子实验素养Evidence before verdict

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24 周大分子实验素养课程

范围说明：本文和配套周学习包只覆盖大分子、抗体和生物药实验素养。

1. 课程目标

本课程不以培养独立完成所有湿实验操作为目标，而是让大分子 CADD/AIDD 负责人能够：

  1. 听懂实验同事描述的 assay、体系、读数和异常；
  2. 判断一个实验是否真正回答了项目问题；
  3. 识别对照、样本、批次、细胞状态、统计和读数中的常见风险；
  4. 把计算预测转化成可执行的实验设计；
  5. 从体外结果、PK/PD 和动物药效之间建立因果链；
  6. 在项目会议中提出准确问题，而不是只询问“结果好不好”。

2. 首要原则：先理解问题，再记 assay 名称

任何 assay 都按下面六个问题学习：

它想回答什么生物学问题？
→ 用了什么样本和模型？
→ 读数是什么，如何产生？
→ 阳性、阴性和背景对照是什么？
→ 哪些混杂因素会造成假阳性或假阴性？
→ 结果如何改变下一步研发决策？

“assay 名称相同”不代表可直接比较。细胞系、靶点密度、效应细胞来源、E:T 比、孵育时间、检测试剂和归一化方法都会改变结果。

3. 学习负荷

标准版

每周 4 小时，24 周完成：概念和方法 2 小时、真实实验报告或图表阅读 1 小时、案例与输出 1 小时。

深入版

每周 6 小时，24 周完成：在标准版基础上增加 1 小时原始资料阅读，以及 1 小时与实验同事进行报告复盘或 teach-back。

无论采用哪种节奏，每周至少阅读一次真实、已脱敏的实验报告或图表，不能只看教材。

4. 第一阶段：8 周最低可用实验语言

第 1 周：Assay 设计与结果语言

完整学习内容、练习、参考答案与综合案例见：第 1 周学习包：Assay 设计与结果语言。

学习内容：

产出：《实验结果审查十问》一页纸。

第 2 周：结合、亲和力与细胞结合

完整学习内容、练习、参考答案与综合案例见：第 2 周学习包：结合、亲和力与细胞结合。

学习内容：

重点问题：纯化抗原结合好，为什么细胞结合或功能不一定好？

第 3 周：高表达、低表达与阴性细胞

完整学习内容、练习、参考答案与综合案例见：第 3 周学习包：靶点表达与细胞模型面板。

这里首先指靶抗原表达水平，而不是蛋白生产产率。

学习内容：

产出：为一个 TCE 项目设计 high/low/negative 细胞面板，写明每种细胞回答的问题。

第 4 周：细胞因子释放与细胞杀伤

完整学习内容、练习、参考答案与综合案例见：第 4 周学习包：细胞因子释放与细胞杀伤。

学习内容：

产出：画出一个 TCE 的“结合—免疫突触—激活—细胞因子—杀伤”机制图，并标注每一步的实验读数。

第 5 周：蛋白表达

完整学习内容、练习、参考答案与综合案例见：第 5 周学习包：重组抗体与蛋白表达。

这里的“高/低表达”指重组蛋白或抗体的表达产率。

学习内容：

产出：《低表达问题树》，区分序列设计问题、细胞问题和纯化损失。

第 6 周：纯化与分析表征

完整学习内容、练习、参考答案与综合案例见：第 6 周学习包：纯化与分析表征。

学习内容：

产出：读一份纯化/分析报告，解释每个峰和每个质量属性影响哪个后续 assay。

第 7 周：动物剂量与给药基本计算

完整学习内容、练习和安全边界见：第 7 周学习包：动物剂量、给药与单位计算。

学习内容：

drug amount (mg) = dose (mg/kg) × body weight (kg)
volume (mL) = drug amount (mg) ÷ formulation concentration (mg/mL)
total amount = Σ(each animal dose) × (1 + overage fraction)

计算例：20 g 小鼠，10 mg/kg，制剂浓度 2 mg/mL。

体重 = 0.020 kg
药量 = 10 mg/kg × 0.020 kg = 0.20 mg
体积 = 0.20 mg ÷ 2 mg/mL = 0.10 mL = 100 µL

这只是单位换算示例，不代表任何具体分子的推荐剂量或给药体积。

产出：完成 10 道 mg/kg、浓度和体积换算题，并让实验同事复核单位。

第 8 周：PK 基本语言

完整学习内容、曲线案例与参考答案见：第 8 周学习包：抗体 PK 基础语言。

学习内容：

阶段产出：读一张抗体 PK 曲线，写出五条观察、三个可能机制和下一步需要的实验。

5. 第二阶段：细胞功能实验深化（第 9–12 周）

第 9 周：Cytokine release assay

完整学习内容、设计卡与综合案例见：第 9 周学习包：Cytokine Release Assay 深入。

第 10 周：TCE/免疫细胞介导杀伤

完整学习内容、实验矩阵与综合案例见：第 10 周学习包：TCE 与免疫细胞介导杀伤。

第 11 周：其他常见功能 assay

完整学习内容与机制 assay tree 见：第 11 周学习包：ADCC、CDC、Reporter、内吞与 ADC。

第 12 周：Assay validation 与跨实验室可比性

完整学习内容、assay card 与 bridging plan 见：第 12 周学习包：Assay Validation 与跨实验室可比性。

阶段产出：选一个现有细胞功能 assay，写一页 assay card：目的、输入、对照、读数、接受标准、变异、局限和决策用途。

6. 第三阶段：PK、PD 与生物分析（第 13–16 周）

第 13 周：生物分析与采样

完整学习内容与采样计划见：第 13 周学习包：生物分析与采样设计。

第 14 周：抗体 PK 机制

完整学习内容与快速清除问题树见：第 14 周学习包：抗体 PK 机制。

第 15 周：ADA、PK/PD 与暴露–效应

完整学习内容与个体因果审查见：第 15 周学习包：ADA、PK/PD 与暴露—效应。

第 16 周：PK 数据阅读

完整学习内容与两页评审模板见：第 16 周学习包：抗体 PK 数据评审。

练习比较：

阶段产出：一份 2 页 PK/PD review note。

7. 第四阶段：小鼠肿瘤模型（第 17–20 周）

第 17 周：模型类型与选择

完整学习内容与模型兼容性矩阵见：第 17 周学习包：小鼠肿瘤模型选择。

模型 核心特点 主要优势 主要局限
CDX 人源肿瘤细胞系植入免疫缺陷鼠 快、重复性较好、易测量 免疫系统缺失、异位环境、细胞系适应
PDX 患者肿瘤组织植入免疫缺陷鼠 保留更多患者异质性 慢、贵、鼠基质替代、免疫功能受限
Syngeneic 小鼠肿瘤植入同品系免疫完整鼠 可研究完整鼠免疫系统 靶点和免疫生物学为小鼠版本
Humanized 免疫缺陷鼠重建部分人免疫系统 可研究人免疫药物作用 变异大、成本高、重建不完整、可能有GVHD
GEMM/knock-in 遗传工程或人源靶点模型 可研究特定机制和物种交叉性 周期长、模型特异、外推仍有限

对 TCE/双抗尤其要核对：人 CD3/靶点交叉反应、靶密度、效应细胞来源、Fc 作用和 cytokine biology。

第 18 周：动物研究设计

完整学习内容与 pre-study memo 见：第 18 周学习包：动物研究设计与偏倚控制。

第 19 周：肿瘤体积和药效终点

完整学习内容、TGI 计算与个体结果案例见：第 19 周学习包：肿瘤体积、药效终点与数据解释。

常见皮下瘤体积近似：

tumor volume ≈ length × width² ÷ 2

不同实验室可能使用不同公式和测量维度，必须在方案与报告中明确并保持一致。

常见表达方式包括：

TGI 有多种定义。使用前必须写明公式，例如基于变化量的形式：

TGI% = [1 − (Tt − T0)/(Ct − C0)] × 100%

不能只报某一天的组均值；还应查看个体曲线、退出动物、删失、基线差异和重复实验。

第 20 周：从动物结果到人类转化

完整学习内容与转化评审模板见：第 20 周学习包：从动物结果到人类转化。

阶段产出：评审一份小鼠药效报告，列出“支持结论的证据、不能推出的结论、下一步实验”。

8. 第五阶段：跨学科闭环（第 21–24 周）

第 21 周：从序列设计到实验样品

完整学习内容与交付/追溯模板见：第 21 周学习包：从序列设计到实验样品。

建立链条：序列/结构设计 → 表达 → 纯化 → QC → binding → functional assay。识别每一步失败如何污染下一步结论。

第 22 周：从体外效力到 PK/PD

完整学习内容与定量场景见：第 22 周学习包：从体外效力到 PK/PD。

建立链条：cell potency → target density → exposure → receptor occupancy → biomarker → efficacy。

第 23 周：项目决策模拟

完整学习内容、数据包与会议模板见：第 23 周学习包：候选选择决策模拟。

选一个候选对：A 的 affinity 更好但表达和 PK 较差；B 的 potency 稍弱但 developability 与 exposure 更好。组织一次模拟候选选择会议，明确权重、风险和补充实验。

第 24 周：结业项目

完整结业数据包、汇报结构和评分量表见：第 24 周学习包：完整证据链。

完成 30 分钟报告：

《一个大分子候选从表达、体外功能、PK 到小鼠药效的完整证据链》

必须包括：

9. 建议资源

  1. NIH Assay Guidance Manual：assay development and validation：学习 assay 的定义、对照、验证、正交实验与 critical path。
  2. NIH Cytotoxicity Assays：理解 LDH、ATP/luciferase、流式等细胞死亡读数及其局限。
  3. FDA：Nonclinical Evaluation of the Immunotoxic Potential of Pharmaceuticals：学习 cytokine release、ADCC/CDC、补体和免疫激活 assay 的 fit-for-purpose 原则。
  4. Flow cytometry guidelines, third edition：学习仪器 QC、gating 和必要对照。
  5. Cytiva protein purification handbooks：选择 Protein A/affinity、IEX、HIC 和 SEC 章节。
  6. Tutorial on monoclonal antibody PK：重点学习 FcRn、TMDD、非特异清除和剂量依赖性。
  7. FDA：Immunogenicity Assessment for Therapeutic Protein Products：理解 ADA 风险及其对 PK、PD、安全性和疗效的影响。
  8. ARRIVE 2.0：用于动物实验的样本量、随机、盲法、统计与规范报告。
  9. NCI PDMR SOPs：了解 PDX 建模、扩增和表征的标准化过程。
  10. NCI PDXNet antitumor activity consensus：学习 PDX 生长、个体曲线、T/C、肿瘤回缩和事件终点的标准化分析。

10. 补充专题：抗体发现路线与分子交付链

需要额外掌握五个经常出现在项目会议中的主题：

  1. 质粒：抗体序列进入细胞表达体系的载体；理解启动子、信号肽、轻/重链表达盒、筛选标记、序列验证和转染级质量；
  2. CRS：cytokine release syndrome，是临床或体内的全身炎症综合征，不等同于体外 cytokine release assay；
  3. 杂交瘤：免疫动物 B 细胞与骨髓瘤细胞融合，获得可长期分泌单克隆抗体的细胞克隆；
  4. 噬菌体展示库：将抗体片段表型与其编码 DNA 连接，通过多轮 panning 富集结合克隆；
  5. 单细胞测序/单 B 细胞抗体发现：从单个 B 细胞获得天然配对的 VH/VL，并结合抗原特异筛选和重组表达验证。

详见：实验术语与待补关键词。

11. 结业标准

  1. 能解释至少 15 种常见 assay 各自回答什么问题；
  2. 能为一个双抗/TCE 设计 high/low/negative 细胞面板和完整对照；
  3. 能区分 cytokine release、activation、proliferation 与 killing；
  4. 能阅读表达、纯化和 QC 报告，并判断样品是否适合功能实验；
  5. 能独立完成 mg/kg、浓度和体积的单位计算；
  6. 能阅读基本抗体 PK 曲线并识别 TMDD、FcRn 与 ADA 风险；
  7. 能比较 CDX、PDX、syngeneic、humanized 和 knock-in 模型；
  8. 能评审动物药效报告的设计、个体数据、统计和外推边界；
  9. 能把计算设计建议转换为可验证的实验假设和优先级。