第 1 周学习包：Assay 设计与结果语言

本窗口课程边界

本学习包只讨论大分子、抗体和生物药实验素养，不包含普通化学、药物化学或小分子 CADD。

本周不是背诵 assay 名称，而是建立统一审查框架：

项目问题
→ 实验模型
→ 样品与关键变量
→ 检测读数
→ 对照和重复
→ 不确定性
→ 项目决策

完成后，应能在项目会上准确表达：

这个实验支持候选在 target-high 工程细胞中的表型活性，但尚未证明在低靶表达或内源表达模型中的选择性；目前只有技术复孔，缺少独立实验、阴性细胞和 reference molecule，因此不足以完成候选排序。

一、本周学习目标

1. 区分 biochemical、biophysical、cell-based、ex vivo 和 in vivo；
2. 区分 endpoint、kinetic、single-point 和 dose–response；
3. 区分 affinity、avidity、potency、efficacy 和 selectivity；
4. 能解释 EC50、IC50、Emax、Hill slope、KD、kon 和 koff；
5. 区分 blank、vehicle、negative、positive、reference 和 untreated control；
6. 区分 technical replicate、independent experiment、biological replicate 和 donor；
7. 识别样品质量、靶密度、细胞状态、内毒素、批次和 assay drift 等混杂因素；
8. 使用《实验结果审查十问》复盘一张真实实验图；
9. 根据证据链而不是单一“最好数字”选择抗体候选。

二、学习时间安排

标准版：4 小时

深入版：6 小时

在标准版基础上增加：

• 45 分钟：阅读 NIH Assay Guidance Manual 指定章节；
• 45 分钟：审阅一份已脱敏的真实实验报告；
• 30 分钟：向实验同事讲解“为什么 EC50 不是抗体的固有常数”；
• 15 分钟：请实验同事纠正术语；
• 15 分钟：把新术语加入实验术语台账。

三、课前诊断

先独立作答，每题标记“能讲清”“大致知道”或“不确定”。

1. biochemical assay 与 biophysical assay 分别回答什么问题？
2. affinity 和 avidity 有什么区别？
3. EC50 是否等于 KD？
4. EC50 更低是否一定代表候选更优？
5. 同一块板上的三复孔能否称为 biological n=3？
6. blank、vehicle 和 negative control 各控制什么？
7. target-high 细胞得到很强活性，能够证明临床相关细胞也有效吗？
8. 一条 dose–response 曲线只有中间部分，没有上下平台，EC50 是否可靠？
9. 抗体聚集和内毒素可能怎样影响细胞实验？
10. “实验重复了三次”还需要追问哪些信息？

四、先按问题理解五类实验

4.1 Biochemical assay

使用纯化的生化组分，观察分子是否影响某个反应。

常见问题：

• 是否阻断配体—受体结合？
• 是否抑制酶活性？
• 是否促进或抑制某个明确的分子反应？

优势是体系相对可控、便于拆解机制；局限是缺少细胞膜、内吞、信号网络和组织环境。

4.2 Biophysical assay

直接测量结合或其他物理性质。

常见方法包括 SPR、BLI、ITC、DSF、SEC 和 DLS。不同方法回答的问题不同：

• SPR/BLI：结合动力学与表观亲和力；
• ITC：结合热效应与热力学参数；
• DSF：热稳定性变化；
• SEC/DLS：单体、聚集和粒径相关性质。

这类实验看似“直接”，仍可能受到固定化方向、传质、多价效应、样品异质性和拟合模型影响。

4.3 Cell-based assay

在细胞环境中测量结合、信号或功能。

常见读数：

• flow cytometry cell binding；
• reporter activation/inhibition；
• receptor occupancy、internalization；
• cytokine release；
• proliferation、apoptosis、cell killing；
• ADCC、CDC 或 T-cell-dependent cytotoxicity。

细胞实验把多个机制步骤整合为一个结果，因此更接近功能，但更容易受到靶密度、细胞状态、效应细胞来源和通路放大的影响。

4.4 Ex vivo

使用离体的原代细胞、全血或组织，例如 PBMC cytokine release、患者来源细胞杀伤和组织切片结合。

它比工程细胞更接近人体生物学，但 donor 差异、样品运输、冻融、细胞组成和离体培养条件会显著影响结果。

4.5 In vivo

在完整动物中观察暴露、药效、药代或安全性，例如 PK、PD、肿瘤药效和细胞因子变化。

in vivo 证据整合了吸收、分布、清除、靶点作用和机体反馈，但仍受物种交叉反应、模型相关性、免疫系统差异和剂量方案限制。

4.6 五类证据如何连接

证据层级不是简单的“越往下越可靠”。低层级实验有利于拆解机制，高层级实验有利于验证综合效果。项目需要的是相互解释的证据链。

五、实验采集方式

5.1 Single-point 与 dose–response

• Single-point：只测一个浓度，适合高通量初筛；无法可靠给出完整 potency、最大效应和曲线形状。
• Dose–response：测一系列浓度，用于估计 EC50/IC50、Emax 和 Hill slope。

单点结果可能受浓度选择影响。例如两个候选在一个高浓度下都达到 90% 效应，但其 EC50、低浓度活性和曲线形状可能完全不同。

5.2 Endpoint 与 kinetic

• Endpoint：在规定时间读取一次结果；简单、适合批量比较，但可能错过早期峰值或恢复过程。
• Kinetic/real-time：连续或多个时间点读取；有助于区分快速与延迟作用、短暂与持续效应。

对于细胞杀伤，24 小时与72 小时 EC50 不能直接当作同一个属性；细胞增殖、serial killing 和候选稳定性都会改变曲线。

六、必须区分的结果语言

6.1 Affinity、avidity、potency、efficacy 和 selectivity

6.2 KD、kon 和 koff

对简单的 1:1 可逆结合模型：

KD = koff / kon

• kon：结合速率常数，常用 M⁻¹·s⁻¹；
• koff：解离速率常数，常用 s⁻¹；
• KD：平衡解离常数，常用 M 或 nM；数值越低通常表示 affinity 越高。

相同 KD 可以来自不同的 kon/koff 组合。多价抗体、受体聚集或表面 assay 可能不满足简单 1:1 模型，此时应特别留意“apparent KD”。

6.3 EC50、IC50、Emax 和 Hill slope

• EC50：达到候选自身拟合响应范围中点的浓度；
• IC50：在指定实验条件下达到 50% 抑制或拟合响应中点的浓度；
• Emax：该实验条件下的最大效应；
• Hill slope：曲线陡峭程度的经验参数。

常见四参数 Logistic 表达为：

Response = Bottom + (Top − Bottom) / [1 + (EC50 / C)^Hill]

不同软件可能使用相反的浓度比或斜率符号，应结合公式和曲线方向解读。

EC50 不是抗体的普适固有常数，更不等于 KD。它还受到以下因素影响：

• 靶点表达量和受体占有阈值；
• 信号放大、内吞和受体周转；
• 效应细胞状态、E:T ratio 和 donor；
• 孵育时间；
• 抗体价态、交联和作用几何；
• 检测方法和归一化方式。

Hill slope 异常不自动证明协同性，也可能提示浓度错误、样品异质性、assay 干扰或曲线覆盖不完整。

七、对照：排除替代解释

对照的本质不是“报告格式齐全”，而是为每个重要替代解释设置可以反驳它的证据。

以 TCE killing assay 为例，至少要考虑：

• effector-only；
• target-only；
• untreated co-culture；
• target-negative co-culture；
• isotype/non-binding molecule；
• maximum lysis 或适当阳性对照；
• reference TCE；
• 如有必要，Fc、CD3 或靶点阻断对照。

八、重复、变异和 assay 质量

8.1 四个容易混淆的“n”

• Technical replicate：同一样本在同一次实验中的重复孔，主要反映移液和读数变异；
• Independent experiment：在不同实验日或独立操作中重新运行完整实验；
• Biological replicate：独立生物来源，如独立细胞培养、动物或组织样本；
• Donor replicate：不同供者来源的 PBMC、全血或免疫细胞。

同一 donor 的三个复孔只是技术重复，不能被写成三个独立供者。看到“n=3”，必须追问 n 的实验单位是什么。

8.2 Assay 质量关注点

• 动态范围：阴性和阳性信号是否充分分离；
• 重复性：同条件多次测量的离散程度；
• 稳健性：小幅改变操作条件时结果是否稳定；
• assay drift：背景、Top/Bottom、reference potency 是否随板次、日期、批次或操作者系统漂移；
• fit-for-purpose：方法验证深度是否与当前决策风险匹配。

筛选型实验有时使用 Z′ factor：

Z′ = 1 − 3(σpositive + σnegative) / |μpositive − μnegative|

它反映对照窗口与变异，但不能替代对原始曲线、样品、机制和独立重复的审查。

8.3 大分子实验常见混杂因素

九、《实验结果审查十问》v1.0

1. 这个 assay 真正想回答的生物学问题和项目决策是什么？
2. 使用的蛋白、细胞、供者或动物模型是什么，与真实机制有何差距？
3. 读数是直接机制读数，还是下游代理终点？
4. 浓度、时间点和关键体系参数是否覆盖合理范围？
5. blank、vehicle、negative、positive 和 reference control 是否齐全且正常？
6. 报告中的 n 是复孔、独立实验、donor，还是动物？
7. 是否展示原始点、误差、完整曲线、Top/Bottom 和拟合质量？
8. 样品聚集、内毒素、细胞状态、靶密度、板位或批次能否解释结果？
9. 效应是否超过 assay 自身变异，并在独立或正交实验中复现？
10. 该结果能改变什么决策，不能推出什么结论，还缺哪条关键证据？

项目会上可以优先问五条主线：

问题 → 模型 → 对照 → 重复 → 决策

十、综合案例：四个抗体候选如何排序

以下数据均为教学示例。

补充信息：

• BLI 只使用一种固定化方向，尚无正交验证；
• 细胞实验只有一个 target-high 工程细胞系；
• 每个浓度有三复孔，但只在同一天做过一次；
• D 的样品轻微浑浊；
• 没有 target-low 细胞、reference antibody 或独立实验。

案例问题

1. 当前主推进和备份候选分别是谁？
2. C 的 KD 最低但 cell potency 最差，列出五个可能原因。
3. D 的 EC50 最低，为什么不能直接排第一？
4. 能否声称 B 的细胞活性显著优于 A？
5. 如果只能新增三项实验，选择什么？每项排除哪种不确定性？
6. 当前数据可以支持哪些结论，不能支持哪些结论？

推荐分析

1. 暂定 B 为主推进、A 为备份。B 的表达、单体、cell potency 和 Emax 更均衡；A 的样品质量和阴性细胞结果可接受。该排序需要独立实验确认。
2. C 的可能原因包括：固定化或拟合造成表观高 affinity；细胞表位不可及；细胞靶点构象或糖基化不同；cell binding 差；内吞或受体周转差异；功能需要特定交联几何；biophysical 与 cell assay 构建不一致。
3. D 的低单体比例、浑浊和阴性细胞高效应提示聚集、非特异作用或 assay 干扰，低 EC50 可能是假性 potency。
4. 不能仅凭一次实验的技术复孔声称稳定或统计显著的候选差异。
5. 一个合理组合是：
   • 重新制备并完成 SEC/样品质量确认，重点排除 D 的聚集影响；
   • 在 target-high、target-low 和 target-negative 细胞上同时做 cell binding 与功能曲线；
   • 独立日期重复并加入 reference antibody。若 BLI 模型风险最高，可把其中一项替换为反向固定或 SPR 等正交验证。
6. 当前只能说“在这一批样品和当前 assay 条件下观察到候选差异”；不能声称临床选择性、稳定排序或明确的因果机制。

十一、20 个本周核心术语

十二、闭卷验收

每题 2 分，共 20 分。

1. 按证据层级列出五类 assay，并各写一个主要局限。
2. affinity 和 avidity 有什么区别？
3. 写出简单 1:1 模型中 KD、kon 和 koff 的关系。
4. 为什么 cell EC50 通常不等于 KD？
5. potency 与 efficacy 有什么区别？
6. single-point 结果相对 dose–response 缺失哪些信息？
7. technical triplicate 能否写成 biological n=3？为什么？
8. target-negative cell 与 isotype control 分别排除什么解释？
9. 列出抗体聚集可能影响的三类 assay 结果。
10. 看到一条漂亮的 dose–response 曲线，还需要检查哪五件事？

评分建议：

• 17–20：通过，可进入第 2 周；
• 13–16：订正错误并完成一次 5 分钟讲解；
• 9–12：重做综合案例；
• 0–8：重新学习第 4–9 节后再测。

十三、本周最终产出

1. 课前诊断和闭卷验收答案；
2. 一张“biophysical → cell-based → ex vivo → in vivo”证据链图；
3. 四个抗体候选的排序及三项补实验；
4. 使用《实验结果审查十问》复盘一张真实、已脱敏的实验图；
5. 5 分钟讲稿：“为什么 affinity 好不等于细胞功能好”。

十四、精选资料

• NIH/NLM Assay Guidance Manual 总目录；
• NIH/NLM Immunoassay Methods：本周只阅读 dose–response、EC50 和曲线拟合部分；
• NIH/NLM Basic Guidelines for Reporting Non-Clinical Data：重点阅读 replicate 和 variability；
• NIH/NLM HTS Assay Validation：重点阅读 controls、inter-plate/inter-day variation 和 assay drift。

十五、学习记录模板

日期：
实际学习时长：

今天能讲清的 3 个概念：
1.
2.
3.

仍然含糊的 2 个概念：
1.
2.

与当前大分子项目最相关的 1 个问题：
1.

准备向实验同事确认的 1 个问题：
1.

本周测验得分：__/20
下周前需要补做：